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4CN即4-氯-1-萘酚(4-Cl-1-Naphthol)是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成蓝紫色不溶性产物。在组织中，不溶性产物会慢慢溶解，也能够溶解于二甲苯等有机溶剂。用于检测过氧化物酶的活性，有灵敏度高，背景低等优点，是HRP结合物最常用的底物，常在免疫组化、原位杂交和Western Blot等膜显色或检测细胞，组织内源性的过氧化物酶中应用比较广泛。

• 显色时间严格控制在30min左右，以免造成过度显色，如果显色过快，要及时用蒸馏水终止反应。
  
• 请使用完后，将反应液、溶液A和溶液B的盖子旋紧，以防止溶液挥发和与空气中的成分发生化学反应。
  
• 推荐所配试剂的量适合于6×8cm的膜，如果膜较大，请适当增加所配试剂的量以便完全覆盖膜。
  
• 请正确配制Western Blot所需要的试剂，正确的膜转移，抗体的稀释和冲洗步骤，以保证能够显色和减少杂带的产生。
  
• 将干燥的膜用干净的保护膜包好，并且在阴暗处储存，否则颜色会渐渐褪去。
  
• 混合后的显色工作液应现用现配，以免失效。
  
• 产品中的保存条件及有效期均以未开封情况下计算，为了防止产品与空气接触发生化学反应影响产品性能，将未使用完毕的组分按存储要求保存同时建议开封后的组分尽快使用完毕。
  
• 本试剂只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等目的，由此产生的后果，概不承担责任。

• 在免疫印迹实验中，先将相应的HRP标记的二抗覆盖膜，37℃于振荡器上振荡1～1.5h，再用1×TBST或者1×PBST洗涤膜3～4次，最后一次用1×TBS或1×PBS洗涤膜，将膜转移到阴暗处。
  
• 显色前先取10mL反应液移置一个15mL的干净棕色瓶中，再依次加入2mL溶液A和10μL溶液B并充分混匀。
  
• 在阴暗处将12mL的显色工作混合液加入膜上，将膜覆盖。37℃振荡30min，这时蓝紫色的条带出现。
  
• 倒掉反应液，双蒸水冲洗条带3～4次，自然干燥，避免光照。
  
• 照像记录实验结果。